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AF647(Alexa Fluor 647)是Alexa Fluor染料家族中一种发远红(far-red)荧光的染料,是最常用的一种AF染料之一,在重要实验中,常常被用于替代Cy5染料。AF647的极性大,水溶性极好,荧光稳定性能也不错,能耐受较长时间照射,特别适应于标记蛋白质,是二抗标记的常规荧光染料。尽管AF647的量子产率不算高,但是其消光系数非常高(即表现为颜色深,分子吸收光子能力强),所以AF647的荧光亮度很高,另外,由于远红光区样品背景弱,而CCD相机对该区光子检测都较灵敏,所以各种因素加成之下,让AF647成为最灵敏的荧光染料之一,常常可检测出丰度非常低的样品。AF647的ex/em和Cy5非常接近,因此在常规荧光显微镜时可使用Cy5滤片组;在共聚焦显微成像时,633nm激光束可以良好的激发该染料,594nm激光也可以通过该染料的肩峰激发,很好的适配了生物实验室常规平台激光器,包括常规共聚焦显微镜、流式细胞仪和荧光扫描仪等。
NHS活化酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯,N-hydroxysuccinimide ester,succinimidyl ester, SE)是生物标记反应中最常用的活化基团。NHS活化AF647分子中的羧基,让它可以和目标生物分子上的胺基(主要伯胺)反应生成稳定的酰胺键,从而把AF647荧光分子标记到生物大分子上。
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