6种固定液短时间固定对冰冻切片制片效果影响

2021-12-15

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。由于其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。但在冰冻切片制过程中影响制片的质量因素较多，从而影响手术中的快速病理诊断。因此，快速制作一张高质量的冰冻切片对于确保病理诊断极其重要。

其中固定是冰冻切片制作中关键步骤之一，对切片的制片质量有着重要的影响。本文通过6种不同固定液短时固定对冰冻切片制片染色的比较，探讨不同固定液对冰冻切片制片效果的影响。

1.资料与方法：

1.1材料：

选自病理科手术切除的新鲜组织标本40例，包括有乳腺、甲状腺、胃、子宫、卵巢等组织。

1.2固定液：

6种固定液分别为：10%福尔马林；95%酒精；AF固定液；丙酮∶甲醇∶乙醚酒精（乙醚∶酒精1∶1）。

1.3方法：

1.3.1：取材及切片取材大小为1.5cm×1.5cm，厚2～3mm的新鲜组织，用OCT包埋剂包埋后，放进徕卡冰冻切片机（温度-18℃～20℃），1～2min后，每例标本连续切片各6张，厚度4～5μm。

1.3.2：固定及染色切片后立即放进上述6种不同的固定液（室温20～25℃）固定6s。将固定过的切片用蒸馏水洗30s，放进改良的GILL苏木素液（预先放在65°恒温水域箱加热）2min，自来水洗，1%盐酸酒精分化液分化10s，温水（50℃）蓝化30s，伊红染色30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。2结果切片制作好后，通过对6种不同固定液的对比，在显微镜下观察切片的组织清晰度、细胞收缩度、细胞核染色、细胞浆染色、核浆对比情况。结果见表1。

表1 6种不同固定液的对比

固定液	组织清晰度	细胞收缩度	细胞核染色	细胞浆染色	核浆对比
10%福尔马林	差	细胞肿胀	差	差	差
AF液	稍差	轻度收缩	稍差	淡	差
95%酒精	较清晰	明显收缩	稍差	稍淡	稍差
丙酮	稍差	严重收缩	稍差	不均匀	差
甲醇	较清晰	轻度收缩	较好	较好	良好
乙醚酒精	清晰	正常	鲜艳	鲜艳	良好

1. 3. 1：取材及切片取材大小为1. 5 cm × 1. 5 cm，厚2 ~ 3 mm 的新鲜组织，用OCT包埋剂包埋后，放进徕卡恒温冷冻切片机（温度-18°C ~ 20°C ），1 ~ 2 min 后，每例标本连续切片各6 张 ,厚度 4 ~ 5 μ m 。

1. 3. 2：固定及染色切片后立即放进上述 6种不同的固定液（室温20 ~ 25°C ）固定 6s。将固定过的切片用蒸馏水洗 30 s，放进改良的GILL 苏木素液（预先放在65° 恒温水域箱加热）2 min，自来水洗,1%盐酸酒精分化液分化 10 s，温水（50°C ）蓝化30 s，伊红染色30 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明, 中性树胶封片。

2 结果：

切片制作好后，通过对6种不同固定液的对比,在显微镜下观察切片的组织清晰度、细胞收缩度、细胞核染色、细胞浆染色、核浆对比情况。结果见表 1 。

从观察结果显示，在 6 种固定液固定的冰冻切片中，经乙醚酒精固定后的冰冻切片，镜下组织细胞形态清晰，细胞无收缩，细胞核、细胞浆染色鲜艳，核浆对比良好。甲醇固定的冰冻切片质量次之。95%酒精固定的切片，除细胞明显收缩外，组织结构较清晰,细胞染色尚可。丙酮和AF液固定的冰冻切片，组织结构较清晰度稍差，细胞浆染色及核浆对比均差, 而且丙酮固定的细胞收缩较为严重。10%福尔马林固定的冰冻切片组织清晰度、细胞核染色、细胞浆染色及核浆比均差，同时细胞肿胀，尤其是细胞核明显肿胀、模糊。

3.讨论：

冰冻切片的目的是在短时间内作出准确的病理诊断，协助临床医生确定病变的范围，决定手术的范围，因此，必须尽一切可能争取时间，争取尽快早出切片，并保证质量，所以快速制作一张高质量的冰冻切片非常重要。中华医学会规定完成冰冻HE染色切片制备时间通常为20~25min，在冰冻切片制片中，固定液的选择及固定的时间长短是冰冻切片 HE染色的一个关键步骤。用于冰冻组织的固定液种类较多，大多数固定液需要固定几分钟至十几分钟时间，如果只固定数秒钟，则大多数切片固达不到诊断的要求。由于冰冻切片是由快速切片，快速固定，快速染色这三个方面相互影响所造成的，其中由于组织固定液因素影响组织细胞形态的改变，对病理医生的诊断影响最大，远比其他技术员操作因素引起的组织细胞形态改变更难把握。研究表明10%福尔马林虽然对组织的穿透力强，固定效果好，但需要固定的时间长，而且它不能抵消因冷冻所引起的细胞内液体的肿胀，所以甲醛固定的组织，核发生肿胀、模糊。从上述6种固定液的比较来看，如果只进行数秒钟的短时固定，10% 的福尔马林和AF 液固定的组织，组织清晰度差，细胞核和细胞浆着色较淡 ,核浆对比差。95% 酒精固定效果尚可，但细胞收缩明显，核浆着色稍差。丙酮固定剂，对组织穿透性强，但细胞严重收缩，核浆对比差。甲醇固定的组织，细胞轻度收缩性,组织结构清晰，核着色好。但是乙醚酒精固定液的冰冻切片能较好的保存细胞的正常结构，组织清晰，背景干净，细胞无收缩，核浆染色鲜艳，核浆对比良好,是 6种固定液中最好的。因此，乙醚酒精可以短时间内固定细胞，缩短制片时间，是一种较为理想的冰冻切片快速固定液。